بررسی نقش پپتیداز نشانه تیپ i انگل لیشمانیا ماژور در بقاء، رشد، عفونت زایی و محافظت با روش از هم گسیختن ژن (gene disruption)

چکیده: انگلهای تک یاخته جنس لیشمانیا طیف وسیعی از عفونت ها را با شدت بیماریزایی متفاوت در انسان ایجاد می کنند که از زخمهای پوستی بهبود یافته تا بیماریهای احشایی بسیار شدید را در بر می گیرد. علی رغم تلاشهای بسیار هنوز کنترل بیماری میسر نگردیده است. در تمام سلولهای زنده اعم از سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت پروتئینهای ترشحی معمولاً بصورت پروتئینهای پیش ساز که دارای یک توالی پپتید نشانه در انتهای آمینی خود هستند ساخته می شوند که پروتئینهای تازه ساخته شده را به مقصد نهایی در پری پلاسم، غشاء خارجی یا محیط خارج سلولی هدایت می کند. این پپتید پس از انتقال پروتئین از غشاء یا در طی عمل انتقال توسط آنزیم پپتیداز نشانه signal peptidase (spase) حذف می گردد. این آنزیم برای حیات باکتریها ضروری می باشد. لیشمانیا یک انگل تک سلولی و دیپلوئید بوده که دارای یک نسخه از ژن spase i است. در این تحقیق عملکرد و نقش آنزیم spase i در لیشمانیا ماژور برای نخستین بار تحت بررسی قرار گرفت و تلاش شد تا ژن مذکور به روش نوترکیبی مشابه حذف و اثرات آن بر روی حیات، رشد و تمایز انگل در دو حالت پروماستیگوت و اماستیگوت، تمایز انگل و خاصیت عفونت زایی آن در شرایطin vitro و in vivo بررسی شود. به منظور از هم گسیختن ژن spase i از طریق نوترکیبی مشابه، دو ساختار پلاسمیدی px63-neo و px63-hyg که حاوی دو ژن مقاومت به آنتی بیوتیک های نئومایسین (g418) و هیگرومایسین b هستند، استفاده شد. دو ناحیه بالا دست ((5?flanking=5?f و پایین دست ((3?flanking=3?f ژن spase i با روش pcr از ژنوم لیشمانیا ماژور جدا و در دو طرف ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک کلون گردید. بخشی از ساختار ناقل نوترکیب که در بر گیرنده ژن مقاومت به همراه دو ناحیه 5?f و 3?f بود با آنزیمهای محدود الاثر از ناقل جدا و تخلیص شد. در مرحله نخست ترانس فکشن، قطعه 5?f-neo-3?f از طریق الکتروپوریشن به درون انگل تیپ وحشی لیشمانیا ماژور وارد و در داخل ژنوم الحاق گردید. انتخاب انگلهای هتروزیگوت ?spase::neo/spase بر اساس مقاومت به آنتی بیوتیک g418 و بر روی محیط کشت نیمه جامد آگار دار صورت گرفت. در مرحله دوم ترانس فکشن، برای حذف آلل دوم ژن spase i ، از قطعه 5?f-hyg-3?f استفاده شد. غربال گری انگلهای هموزیگوت بر روی محیط کشت آگار دار حاوی دو آنتی بیوتیک g418 و هیگرومایسین b انجام شد. اما عدم رشد انگل نشان می دهد که احتمالاً حذف هر دو آلل در انگل لیشمانیا ماژور امکان پذیر نیست. برای بدست آوردن انگل هتروزیگوت ?spase::hyg/spase انگل های تیپ وحشی با قطعه 5?f-hyg-3?f ترانس فکت شدند و انگلهای هتروزیگوت مقاوم به آنتی بیوتیک هیگرومایسین b بر روی محیط کشت آگاردار بدست آمد. اما این انگلها در محیط مایع نسبت به هیگرومایسین b حساسیت بالایی از خود نشان دادند. نتایج pcr و ساترن بلات انگلهای جهش یافته هتروزیگوت ?spase::neo/spase و ?spase::hyg/spase به وضوح نشان داد که ژنهای هر دو آنتی بیوتیک در جایگاه لوکوس ژنspase i جایگزین شده است. همچنین آزمونهای وسترن بلات و rt-pcr نشان داده اند که آنزیم پپتیداز نشانه در انگلهای هتروزیگوت ?spase::neo/spase بیان می گردد. مشاهدات میکروسکوپی انگلهای جهش یافته هتروزیگوت ?spase::neo/spase حاکی از آن است که این انگل ها دچار تغییر در شکل ظاهر شده اند. بطوریکه اندازه آنها به یک سوم اندازه انگل تیپ وحشی رسیده و تا حدودی از تحرک آنها کاسته شده است. بررسی قدرت بیماری زایی انگلهای هتروزیگوت ?spase::neo/spase نشان داد که این انگلها در مقایسه با انگل تیپ وحشی قادر به ایجاد عفونت در کف پای موشهای حساس balb/c نیستند. این انگلها در درون بافتهای مختلف طحال، غدد لنفاوی و کف پای موشهای آلوده در مقایسه با انگل تیپ وحشی از پایداری کمتری برخورداراند. بطوریکه در زمانهای مختلف (از 1-12 روز) پس از تزریق، انگل زنده در بافت کف پای کشت داده شده مشاهده نگردید. نتایج real-time pcr از بافتهای مختلف موشهای آلوده به روشنی نشان داد که بقاء انگل هتروزیگوت در بافتهای مختلف از جمله کف پای موشهای آلوده به طور قابل ملاحظه ای کاهش یافته است. نتایج کسب شده از آزمون in vitro با استفاده از ماکروفاژهای آلوده و in vivo کاهش چشمگیر قدرت بیماری زایی انگلهای هتروزیگوت را نسبت به انگلهای تیپ وحشی آشکار می کند. نتایج این مطالعه این فرضیه را قوت می بخشد که احتمالاً انگلهای هتروزیگوت توان تمایز و یا تکثیر در درون سلول را تا حد زیادی از دست داده اند. اطلاعات بدست آمده از این تحقیق که برای نخستین بار گزارش شده است بطور خلاصه عبارتند از: 1- spase i یک ژن ضروری و حیاتی برای شکل پروماستیگوت انگل است. بطوریکه حذف هر دو آلل آن امکان پذیر نیست. 2- حضور این آنزیم احتمالاً در تمایز شکل پروماستیگوت به اماستیگوت حائز اهمیت است. 3- بیان این پروتئین در تکثیر، بقاء و پایداری انگل در درون ماکروفاژ ها در شرایط in vitro از اهمیت خاصی برخوردار است. 4- فعالیت آنزیم پپتیداز نشانه در ایجاد عفونت در بدن موشهای حساس balb/c الزامی است.